长时间保存会影响细胞胞质量吗？

长期冻存再恢复后，会影响细胞活力吗？

……

抛开储存方式去谈储存年限就是“耍流氓”，而细胞冻存这一技术在全球科研领域，实际上已经拥有相当长的时间了。

从冷冻生物学理论分析，在-196℃深低温条件下，细胞的活性可以长期保存。关于细胞冻存技术，可以追溯至1776年。

• 1776年

  Spallanzani（1776）最早发表了冷“处理”对“细胞”生命活动影响的报道，他用雪冷冻玻璃瓶中的马精子10多分钟之后，再将玻璃瓶放回室温下，发现了一个令人惊奇的现象，那些原本已经不动了的精子又“复活”了，就好象是刚从输精管排出来的一样，冷处理延长至数十分钟，情况依然如此。于是，他认为冷不能杀死精子。大约100年以后，许多早期的学者重复了低温处理对精子活动的影响，同样得出了相似的结论。到1900年前后，科学家基本上肯定了生物成分（如精子和一些生物化学物质）能够在零下温度贮存的事实。参考出处：丁香园

• 十九世纪中后叶

  十九世纪中后叶，许多早期的工作者(Prevost,1840;de Quatrefages,1853;Mantegazza,1866;Scheuk,1870)重复研究了低温处理对精子活动的影响,得出了和 Spallanzani相似的结论。即“冷不能杀死精子”。

• 1900年前后

  1900年前后，科学家基本上肯定了生物成份能够在零下温度储存的事实。

  
  

• 20世纪50年代

  20世纪50年代，Luyet等多位学者发现了电解质浓度对储存细胞的损伤作用，他们的基本结论是。电解质浓度增大是造成储存细胞损伤的主要原因。

• 60年代

  60年代，美国纽约血液中心Rowe实现了红细胞的低温保存。1980年，他将在液氮温度下保存了12年的红细胞复苏后进行检查，没有发现任何生化和功能上的变异，从而从实践上证明了生物材料可以在低温下长期存活。

• 70年代

  70年代，Mazur等首先根据中国仓鼠组织培养细胞的低温保存实验数据分析，提出关于冷冻损伤的两因素假说目，即冰晶损伤和溶液损伤假说。

• 80年代

  80年代以来，理学和工程学进入低温保存研究领域，低温工程理论及实用设计原理的不断更新及应用，低温生物学的研究快速发展。

• 20世纪

  20世纪以来，人类的科学研究进入细胞水平阶段，开始对生物和作为食品原料的生物材料进行低温保存处理。到了20世纪末，随着科学方法的不断进步以及冷冻方法的不断完善，低温保存技术广泛地应用到了临床上。

今天我们探讨脐带间充质干细胞的储存年限，也要先从脐带血的储存方式说起。脐带血是被储存在零下196℃的液氮罐中的，而在被放入液氮储存前这份脐带血则会被特殊处理。

图示：惟力维斯生命银行

首先，为了防止造血干细胞在低温环境中破损，会在脐带血中加入冷冻保护剂。冷冻损伤主要发生在0℃到零下60℃，这段温度区间被称为“危险温度区”，而冷冻保护剂的使用可以保护细胞，尽可能免受冷冻损伤。

其次，储存脐带血时要使用程序降温仪，严格按照预设程序冷冻后达到目标温度，低至一定的温度后才可以转入-196℃深低温液氮中进行长期冻存。

这种程序性降温，使脐带血造血干细胞的活性得到最大程度的保护，以免其出现我们常说的“冻死”。

图示：程序降温仪

冻存脐带血造血干细胞是一项看似简单却极具技术含量的系统工程，脐带血放入液氮罐正式储存前，为了防止造血干细胞在低温环境中破损，需要对脐带血加入冷冻保护剂，进行降温处理。

在降温的过程中，要利用专业的计算机程序逐步缓慢降低温度至-90℃后才可以转入-196℃深低温液氮中进行长期冻存，保证干细胞的活性。

细胞制备

而且在冻存过程中，所有液氮罐需由真空管道相连，终端连接液氮存储塔，对已经储存的脐带间充质干细胞进行24小时不间断补充液氮。

为了保证脐带间充质干细胞存储环境的安全性，还需使用闭路监控、红外线报警、液位监视、双电路供电、氧含量实时监控等24小时不间断监控系统严格监控，至此，一份脐带血才能长期保存下来供临床使用。

在液氮罐中“沉睡”20年之后，被冻存的脐带血到底能不能“苏醒”过来呢？我们看看真实的数据：

• 2012年

  2012年，北京市道培医院救治一位49岁，体重达87公斤的白血病患者，脐血库为其提供一份1998年已经冻存14年的脐带血， 复苏后细胞活性达96%。

• 2014年

  2014年9月2日，刘女士(化名)在山东第一医科大学第一附属医院（原山东省千佛山医院）成功接受单份脐带血移植。该份脐带血于2000年11月22日入库，到移植时已储存了长达14年，在出库复核时，细胞活性和有核细胞数完全符合移植条件。

• 2014年

  2014年12月，11岁湖南女孩晓颖在广州南方医院接受干细胞治疗。而植入晓颖体内的这份脐血，是在2000年在广东省妇幼保健院采集的，已经储存了15年，移植前复苏活性检测高达94.2%。

• 2017年

  2017年一份采集于1998年5月，冻存18年11个月的脐带血，复苏后细胞活性为97.16%。

• 2018年

  2018年，一份1998年6月采集的脐带血，冻存了20年零4个月，复苏后活性为99.75%！

• 2020年

  2020年4月23日，北京市脐血库抽检一份冻存于1998年7月19日的脐带血，复苏后造血干细胞活性高达98.98%。该份脐带血的冻存有效期为21年零9个月，刷新了北京市脐血库脐带血冻存有效期纪录。

从这些数据我们可以看到即便是长期冻存的脐带血，复苏之后，活性仍然很高，依然能够很好地适用于临床。目前也已有很多实验证明，经成功低温保存的细胞在-196℃的温度中保存数十年，复温后检查，未发现任何生化和功能化的变异。

数据来源：《山东省脐血库》

21世纪，将是细胞治疗的时代。

这项颠覆性发展，俨然催生了医学前沿技术的变革，干细胞为临床疑难疾病治疗提供了新手段，免疫细胞作为人体的”守卫军“被应用到疾病治疗、抗衰老、抗肿瘤中，作为医学前沿技术，它们在国际上也备受“宠溺”，正在引领一场医学革命。